什么是代谢组学

1. 什么是非靶向代谢组学和靶向代谢组学?

非靶向代谢组学(Untargeted metabolomics):即非目标代谢组学或发现代谢组学,无偏向性地对所有小分子代谢物同时进行检测分析的代谢组学。

靶向代谢组学(Targeted metabolomics):即目标性代谢组学或定量代谢组学,仅对感兴趣的目标性代谢物进行同时定量分析的代谢组学。

2. 代谢组学可以研究哪些样本?

代谢组学可以研究各类生物样本

按物种分:人、动物、植物、微生物等

按样本类型分:细胞、组织、生物体液,其中生物体液主要有血清/血浆、尿液、脑脊髓液、胆汁、精液、唾液等。

3. 代谢组学有哪些应用?

近年来,代谢组学技术得到了迅速发展,主要可应用于 功能基因组学疾病早期诊断病因病机研究药物毒理学中医药现代化植物代谢组学微生物代谢组学营养学环境科学等领域。

实验设计与样本处理

1. 代谢组学生物学重复如何设计?

一般来说,植物、细胞、微生物等最少6个生物学重复;
动物样本,由于其个体化差异较大,包括组织、血、尿液等至少10个生物学重复;
临床样本,个体差异更大,血浆、尿液等要在30个生物学重复左右,无上限。具体根据文章发表档次和设计定。

2. 样本收集和处理应遵循哪些原则?

代谢组学样本的采集及处理规范标准化至关重要,稍不注意极可能导致结果“失之毫厘,谬以千里”,在样本采集和处理时需遵循以下原则:

快速原则

在采集、处理及快递过程中,需全程保持低温

低温原则

在采集、处理及快递过程中,需全程保持低温

代表性原则

取样必须具有代表性,尤其是粪便、组织等样本

一致性原则

各个样本的采集、处理均应保持高度一致,如采样部位、离心速率、试剂和耗材品牌等

避免污染

最好采用无菌器材,保持实验室清洁,避免杂质混入样本等

为了保证结果的准确性,我公司制定了各类样本严格的采集、处理操作规程,客户可联系我们获取相关资料。

3. 样本采集、处理时需要注意哪些事项?

样本采集:

血浆样本建议使用EDTA或肝素钠作为抗凝剂;动物尿液,如24 h大鼠尿液采集时需加入叠氮化钠;组织样本建议活体采集,若是动物样本建议麻醉后采集,麻醉剂建议使用异氟醚;细胞样本要避免细胞破裂。

样本处理:

使用液氮快速冷冻处理样本;血液样本采集时一定要避免溶血;避免样本反复冻融;使用干冰冷藏运输。

4.需要准备多少量的样本?

代谢组学对各类型样本的需求量有所差异,我们一般要求:

血浆、血清、小鼠尿液:大于250 μL/例

临床尿液:大于5 mL/例

发酵液:大于50 mL/例

肠道内容物、动物组织及器官:大于500 mg/例

昆虫、植物组织:大于1 g/例

微生物干重:大于300 mg/例

细胞样本:需1x107个/mL

其他类型的样本送样量可以联系我们进行确认。

5.样本如何储存、运输?

各类生物样本应储存于-80℃冰箱或液氮罐中;运输的过程中请使用并保证足够的干冰(一般以3公斤干冰/天挥发算)。

非靶向代谢组学检测平台

1. 代谢组学检测平台有哪些,如何去选择?

主要检测平台有GC-MS、LC-MS和NMR。所有的样品类型都可以用这3种平台检测。

● 一般来讲植物类型的样品优选GC-MS(初级代谢产物),然后考虑做LC-MS(次级代谢产物)

● 血浆优选LC-MS

● 尿液优先LC-MS和NMR

● 组织样本优选LC-MS

● 微生物优选GC-MS和LC-MS

具体选择哪种平台需要根据项目具体分析。

2. 代谢组学平台各自优缺点是什么?

NMR、GC-MS和LC-MS比较

序号 分析平台 优点 缺点
1 NMR 高通量;普适性;良好的客观性和重现性;快速(2~3 min/样);预处理简单,不需要衍生化和分离;无损伤性;能检测样品中大多数有机类化合物;仪器使用寿命长 检测动态范围窄;灵敏度和分辨率较MS低;样品用量相对大(0.1~0.5 mL);仪器成本高
2 GC-MS 高通量;高精密度、灵敏度及重现性;具有可参考的标准谱图数据库,易于定性;样品用量适中(0.1~0.2 mL);可检测样品中大多数有机和部分无机分子 需要衍生化;需要分离;分析速度较慢(20~40 min/样);较难鉴定新化合物;不适用于难挥发性、热不稳定性物质的分析
3 LC-MS 高通量;高分别率、灵敏度;检测动态范围宽;样品处理简单,不需要衍生化;样品用量少(10~100 μL);适用于热不稳定性、不易挥发、不易衍生化和分子量较大的物质 分析速度较慢(15~40 min/样);缺少可以参考的标准谱图数据库;较难鉴定新化合物;成本较高;仪器寿命较短

3. 哪些类型的机器(LC-MS)可以做非靶向代谢组学?

目前可以做非靶向代谢组学的机器主要为高分辨率的液质联用设备,设备主要为Q-TOF,Orbitrap这两种类型的机器,一般都能做到5ppm内的分辨率,满足非靶向代谢组学的需求。我公司目前拥有高分辨率质谱Thermo LTQ Orbitrap XL系统。

4. LC-MS可以检测哪些类型的物质?

我公司用到的离子源主要是ESI源的,比较适合于检测中等极性化合物和高极性化合物的物质,从具体的物质类型来讲,有 脂肪酸醇类酚类维生素类有机酸多胺核苷酸多酚萜烯黄酮脂类 等化合物。

5. GC-MS测水溶性的物质主要能测哪些类型的物质?

主要可检测氨基酸、有机酸、脂肪酸、糖、多元醇、胺类、糖磷酸等物质,主要涉及氨基酸代谢、糖代谢、TCA循环等代谢通路。这里值得注意的是,GC-MS测水溶性的物质需要衍生化,因为只有当样品能挥发且遇热稳定时才能直接进行GC-MS分析。

6. 你们公司的GC-MS用的是什么机器,什么柱子,符合发表代谢组文章的要求么?

我公司拥有Agilent 7890A气相色谱仪5975C质谱仪系统,色谱柱为HP5 MS(30 m × 25 mm)。此系统已经广泛应用到食品、农业、医学等各个领域,相关文章已经发表至 PNASanalytical chemistryMetabolomicsJournal of Chromatography BJournal of Chromatography A 等高水平的杂志。

代谢组学数据分析

1. 非靶向代谢组学如何做质控?

质控的目的是考察系统的稳定性,我们会将所有样本混合作为质控(QC)样本。一般每隔10个样本进一针质控样本,结果以QC样本误差2SD以内,PCA图上不分离为标准。我公司QC样本的分析不单独收取任何费用

2.代谢组学分析常用数据库有哪些?

主要定性数据库有:

NISTGMDHMDBMetlinMassBank

主要代谢通路分析数据库有:

Pathway viewers KEGG代谢组学在线数据分析系统MetaboAnalyst

3.GC-MS分析的时候有一些同分异构体,如何解决?

我们公司在用GC-MS代谢组的过程中,考虑到了这些问题:

(1) 首先我们会通过NIST,GMD,weily及本公司已有的一些数据库进行搜库鉴定,寻找最相似的一些物质;

(2) 然后我们会结合待检物质的保留指数(Retention indices)进行物质精确定性,以上两步保证了物质的精确定性,包括同分异构体;

(3) 同时如果待检物质在我公司具有标准品(我公司超过百种标准品),会最终定性该物质。

4.LC-MS代谢物定性一般步骤是什么?

首先采用高分辨率质谱Q-TOF或Orbitrap通过一级质谱分子量全谱扫描,获得的结果实质上为物质的分子量,由于依旧有10ppm内的误差及一个分子量可能有多个物质对应,需要进行二级质谱打碎物质,获得物质碎片,最终通过搜库和标准品来最终确认。

5.你们能提供哪些数据分析内容?

我们能提供完善的代谢组学数据分析内容,主要包括:

(1) 数据预处理——数据质量控制、TIC/BPC图、总体代谢物层次聚类分析和总体样本树状分析等;

(2) 多元统计分析——PCA、PLS-DA、OPLS-DA分析;

(3) 差异代谢物的筛选与注释;

(4) 统计分析——箱式图/柱状图、Z-score图、差异代谢物层次聚类分析、关联热图分析、ROC曲线分析等;

(5) 高级数据分析——代谢通路分析、差异代谢物关联网络分析等;

具体的分析内容需根据项目内容及样本类型而定

靶向代谢组学

1. 你们靶向代谢组学平台有哪些?

我们靶向代谢组学分析平台主要有液相色谱系统、Aglient 7890A/5975C气-质联用仪系统和AB Sciex API 4000™ LC/MS/MS系统。

2. 靶向代谢组学为什么还需要做方法验证?

代谢物定量是一个严谨的过程,液相、气相及质谱本身稳定性的特点,除了需要进行制作标准曲线以外,任需要进行的验证内容有: 准确度精密度(包括重复性、中间精密度和重现性)专属性检测限定量限等, 应视具体方法拟订验证的内容,这样才能保证定量是准确可靠的。

3.靶向代谢组学为什么一定要提供标准品?

靶向代谢组学是针对目标代谢物进行定性定量分析的一门研究,其中定量的过程中,需要首先建立目标代谢物的标准曲线,然后才能进样分析,所以需要提供标准品,我公司也可以提供标准品代购服务。